“鸡奸者”的指控是达·芬奇一生的隐痛。1476年，他被控与17岁的男模特发生关系，在两次听证会后，这案子因为证据不足而不了了之。这次审判无疑给达·芬奇带来了巨大的心灵创伤，之后的岁月里，他竭尽所能保护自己的私生活，甚至用倒写法隐藏真实思想。所以，一切关于他是同性恋的猜想都停留在捕风捉影的阶段。

但不论如何，这仍是人们最津津乐道的话题。许多历史学家指出达芬奇倾向于男性，他一生从未与任何女人有过亲密关系，他的画作也证明了他对男性美的迷恋。他的素描基本上只针对男性裸体，对性器官的描绘尤其引人注意，而与之形成鲜明对比的是，他很少画到女人脖子以下的部分，即便画了，性器官也非常模糊甚至扭曲。

另外，达·芬奇笔记本里的许多注释暗示了他与男学生Gian Giacomo de' Caprotti的暧昧关系，据说这关系持续了20年。达·芬奇去世前不久完成的画作《施洗圣约翰》美丽却妖冶，画中那男女莫辨的圣约翰原型就是Caprotti。

1910年，弗洛伊德利用达·芬奇的笔记作为原材料对其性取向进行了深入研究。他认为，达·芬奇将他的性欲表达在作品中，许多未完成的作品便是一种性挫败的象征。